標(biāo)題《組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-2的表達(dá)純化及活性鑒定》
摘要：組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-2(TIMP-2)抑制腫瘤遷移及侵襲。文中以人TIMP-2為研究對(duì)象,探索人TIMP-2蛋白的原核表達(dá)特征,并進(jìn)行純化及活性鑒定。以人肺癌A549細(xì)胞的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板,克隆人TIMP-2基因,構(gòu)建pET28a重組表達(dá)載體;經(jīng)酶切檢測(cè)和測(cè)序分析的重組表達(dá)載體pET28a-TIMP-2轉(zhuǎn)入大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)中,利用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá),并對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)鎳親和柱純化后,用Westernblotting法鑒定融合蛋白His-TIMP-2,并用明膠酶譜法檢測(cè)融合蛋白的活性。研究發(fā)現(xiàn)融合蛋白His-TIMP-2在E.coliBL21(DE3)中以包涵體的形式存在;在一定范圍內(nèi),IPTG濃度對(duì)His-TIMP-2的表達(dá)量沒(méi)有顯著影響;而在該表達(dá)系統(tǒng)中,誘導(dǎo)溫度和時(shí)間是關(guān)鍵參數(shù),His-TIMP-2的表達(dá)量隨誘導(dǎo)溫度升高而增加;純化并復(fù)性后的融合蛋白His-TIMP-2能有效抑制人肺癌A549細(xì)胞表達(dá)的基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。具有活性的融合蛋白的獲得為后續(xù)深入研究人TIMP-2的功能及機(jī)制奠定基礎(chǔ),并對(duì)腫瘤治療具有重要意義。
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