目的和要求

掌握考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。學(xué)習(xí)分光光度計(jì)的原理及使用法。

原理

1976年Bradford建立了用考馬斯亮藍(lán)G250與蛋白質(zhì)結(jié)合的原理，迅速、敏感的定量測(cè)定蛋白質(zhì)的方法。染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后引起染料zui大吸收的改變，從465nm變?yōu)?95nm，光吸收增加。蛋白質(zhì)染料復(fù)合物具有高的消光系數(shù)，因此大大提高了蛋白質(zhì)測(cè)定的靈敏度，zui低檢出量為1μg蛋白。染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合是很迅速的過(guò)程，大約需2min，結(jié)合物的顏色在1h內(nèi)是穩(wěn)定的。一些陽(yáng)離子，如K+，Na+，Mg2+，（NH 4 ） 2 SO 4，乙醇等物質(zhì)不干擾測(cè)定，而大量的去污劑如TritonX100，SDS等嚴(yán)重干擾測(cè)定，少量的去污劑可通過(guò)用適當(dāng)?shù)膶?duì)照而消除。由于染色法簡(jiǎn)單迅速，干擾物質(zhì)少，靈敏度高，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。

操作步驟

一、標(biāo)準(zhǔn)方法

取含 10～100μg蛋白質(zhì)溶液于小試管中，用雙蒸水或緩沖液調(diào)體積到0.1mL，然后加入5mL蛋白試劑，充分振蕩混合，2min后于595nm測(cè)定光吸收值。以0.1mL雙蒸水或緩沖液及5mL蛋白試劑作為空白對(duì)照。

二、微量蛋白分析法

取含 1～10μg蛋白質(zhì)溶液，用雙蒸水調(diào)體積到0.8mL，加0.2mL蛋白試劑，充分振蕩混合， 2min后于595nm測(cè)定光吸收值，以0.8mL雙蒸水及0.2mL蛋白試劑作為空白對(duì)照。用不同濃度的蛋白質(zhì)溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線作為定量的依據(jù)。

試劑和器材

一、試劑

1.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：可用牛血清清蛋白預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量，根據(jù)其純度配制成1mg/mL的溶液。或根據(jù)牛血清清蛋白的紫外消光系數(shù)A 1% 1cm=6.6來(lái)確定。

2.蛋白試劑的配制：稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G250溶于50mL95%乙醇，加入100mL85%（W/V）磷酸，將溶液用水稀釋到1000mL。試劑的終濃度為0.01%考馬斯亮藍(lán)G250，4.7%（W/V）乙醇，和8.5%（W/V）磷酸。

二、器材

1.72型分光光度計(jì)

2.微量注射器

3.試管及試管架

4.刻度吸管